PhD defense - Amélie Besombes (eq. F.-X. Barre - Genome Biology dpt)

Titre: Implication de la co-hélicase DciA dans la réplication chez Vibrio cholerae

Résumé : Lors de la réplication bactérienne, les hélicases réplicatives séparent les deux brins d’ADN devant la fourche de réplication. Chez les bactéries, la gestion de ces hélicases pendant l’initiation de la réplication a été extensivement étudiée chez Escherichia coli, une bactérie dans laquelle la charge et l’activation de l’hélicase, DnaB, sont strictement dépendantes de la co-hélicase DnaC in vitro et in vivo.
Une analyse phylogénétique a permis d’établir que la présence de DnaC est restreinte à quelques espèces bactériennes seulement ; la plupart possédant à la place la co-hélicase bactérienne ancestrale, DciA. In vitro, DciA augmente l’efficacité de chargement de DnaB, mais contrairement aux systèmes DnaC, les hélicases utilisant DciA sont capables de se charger seules sur l’ADN. In vivo, des analyses cytométriques ont confirmé l’indépendance de DnaB, vis-à-vis de sa co-hélicase DciA, dans sa charge et son activation. DciA n’est donc pas nécessaire au chargement de DnaB, pourtant, comme DnaC, elle est essentielle. Dans ce contexte, notre objectif est d’investiguer le rôle de DciA dans l’initiation de la réplication chez Vibrio cholerae.
Une analyse du programme de réplication via la fréquence des marqueurs génétiques (MFA) dans une population déplétée en DciA révèle un déficit de la réplication du bras droit du chromosome 1 (Chr. I) comparé au bras gauche, similaire à la population sauvage. Ce profil s’explique par la présence de deux populations, l’une dont la réplication est bidirectionnelle et l’autre unidirectionnelle du côté gauche. Les profils MFA de souches mutantes de la réparation de cassure d’ADN, indiquent l’implication de la protéine RecB dans tous les évènements d’initiation en absence de DciA. Grâce au développement d’une technique dédiée, nommée NSA-seq, j’ai pu mettre en évidence l’appariement entre brins néosynthétisés spécifiquement à gauche de l’origine révélant la présence d’extrémités d’ADN double brin (reconnues par RecB), formées dans le cas d’une progression unidirectionnelle de la fourche. La dégradation du Chr. I a été déduite de l’observation, par cytométrie en flux et par MFA, d’une sous-population composée uniquement du Chr. II, alors que sa réplication est dépendante de celle du Chr. I.
Nous proposons un modèle expliquant l’ensemble de nos données. En absence de DciA, une seule hélicase réplicative est chargée et activée au niveau de l’origine de réplication, assurant la réplication du bras gauche du Chr. I. Les contraintes topologiques devant la fourche de réplication gauche, couplées à l’absence de fourche à droite, conduisent à l’appariement des brins néosynthétisés à partir des extrémités laissées libres au niveau de l’origine. Ces structures peuvent ensuite être prises en charge par des activités de redémarrage des fourches, telles que RecB, qui permettra de démarrer la réplication à droite, assurant ainsi une réplication bidirectionnelle à partir d’une initiation unidirectionnelle. Sans prise en charge par ces activités de réparation, la réplication initiée unidirectionnellement conduirait à la dégradation du Chr. I.
La réplication unidirectionnelle est-elle la raison de l’essentialité de DciA ?  Pour y répondre, une réplication unidirectionnelle a été induite indépendamment de DciA. Malgré un niveau de dégradation similaire du Chr. I, la souche reste viable. La démonstration que l’essentialité de DciA est indépendante de son rôle dans l’initiation du Chr. I a pu être obtenue en montrant la létalité d’une souche dont l’initiation dépend uniquement de l’oriII, donc indépendante de DciA. Par l’ensemble de ce travail nous pouvons conclure que DciA assure ainsi la bidirectionnalité de l’initiation de la réplication et présente un autre rôle essentiel qui reste à découvrir.

Composition du jury :
 - Sarah BIGOT, Directrice de recherche, CNRS, Université de Lyon [Rapporteur]
 - Bianca SCLAVI, Directrice de recherche, CNRS, Sorbonne Université [Rapporteur]
 - Stéphane DUIGO, Chargé de recherche, CNRS, Ecole Polytechnique [Examinateur]
 - Meriem EL KAROUI, Directrice de recherche, CNRS, ENS Paris-Saclay [Examinatrice]
 - Sarah LAMBERT, Professeure Université Paris Cité, Institut Curie [Examinatrice]

Title: Implication of the co-helicase DciA in replication in Vibrio cholerae

Abstract : During bacterial replication, replicative helicases separate the two strands of DNA in front of the replication fork. In bacteria, the management of these helicases during replication initiation has been extensively studied in Escherichia coli, a bacterium in which the loading and activation of the helicase, DnaB, are strictly dependent on the co-helicase DnaC in vitro and in vivo.
Phylogenetic analysis has established that the presence of DnaC is restricted to only a few bacterial species; most instead possess the ancestral bacterial co-helicase, DciA. In vitro, DciA increases the loading efficiency of DnaB, but unlike DnaC systems, helicases using DciA are capable of loading onto DNA on their own. In vivo, cytometric analyses have confirmed the independence of DnaB from its co-helicase DciA in terms of loading and activation. DciA is therefore not necessary for DnaB loading, yet, like DnaC, it is essential. In this context, our objective is to investigate the role of DciA in replication initiation in Vibrio cholerae.
An analysis of the replication via the frequency of genetic markers (MFA) in a DciA-depleted population reveals a deficit in replication of the right arm of chromosome 1 (Chr. I) compared to the left arm, similar to the wild population. This profile can be explained by the presence of two populations, one with bidirectional replication and the other with unidirectional replication on the left side. The MFA profiles of mutant strains of DNA break repair indicate the involvement of the RecB protein in all initiation events in the absence of DciA. Thanks to the development of a dedicated technique called NSA-seq, I was able to highlight the pairing between newly synthesised strands specifically to the left of the origin, revealing the presence of double-stranded DNA ends (recognised by RecB), formed in the case of unidirectional fork progression. The degradation of Chr. I was deduced from the observation, by flow cytometry and MFA, of a subpopulation composed solely of Chr. II, even though its replication is dependent on that of Chr. I.
We propose a model explaining all of our data. In the absence of DciA, a single replicative helicase is loaded and activated at the origin of replication, ensuring replication of the left arm of Chr. I. The topological constraints in front of the left replication fork, coupled with the absence of a fork on the right, lead to the pairing of newly synthesized strands from the ends left free at the origin. These structures can then be taken over by fork restart activities, such as RecB, which will allow replication to start on the right, thus ensuring bidirectional replication from a unidirectional initiation. However, without these repair activities, unidirectionally initiated replication would lead to the degradation of Chr. I.
Is unidirectional replication the reason for the essentiality of DciA?  To answer this question, unidirectional replication was induced independently of DciA. Despite a similar level of degradation of Chr. I, the strain remains viable. The demonstration that the essentiality of DciA is independent of its role in Chr. I initiation was obtained by showing the lethality of a strain whose initiation depends solely on oriII, and is therefore independent of DciA. Based on this work, we can conclude that DciA ensures the bidirectionality of replication initiation and has another essential role that remains to be elucidated.