PhD defense - Orlando Moranchel (eq. F.-X. Barre - Genome Biology dpt)

Titre : Génèse des arrangements de prophages conférant sa toxigénicité à Vibrio cholerae 

Résumé : 

Le bactériophage filamenteux lysogénique CTX (Cholera ToXin) encodant la toxine cholérique est responsable de la pathogénicité de la bactérie Vibrio cholerae, responsable du Choléra. CTX s’intègre au chromosome de son hôte en exploitant la machinerie Xer de l’hôte. Plusieurs autres éléments utilisant ce mécanisme sont retrouvés dans le génome des souches pandémiques de V. cholerae. Appelés IMEX (Integrative Mobile Elements exploiting Xer), ils sont tous insérés au site dif où agissent les recombinases à tyrosine XerC et XerD, et forment des arrangements de prophages pouvant varier en fonction du nombre, de l’ordre et des types d’IMEX. L’analyse de ces arrangements a toutefois permis de dégager des particularités communes à toutes les souches. Ma thèse cherche à expliquer certaines de ces observations en révélant de nouveaux aspects du cycle de vie des IMEX.

Le bactériophage satellite TLCΦ (Toxin-Linked Cryptic) est un IMEX invariablement retrouvé en amont de CTX. Il a été proposé que son intégration en premier restore la fonctionnalité d’un site dif ancestral, permettant l’intégration de CTX. Cependant, j’ai montré que le site dif ancestral est fonctionnel. Il permet l’intégration de CTX au même niveau que le site reformé par TLC. J’ai ensuite cherché une autre raison pour expliquer la présence de TLC dans les souches pandémiques. La protéine XafT encodée par TLC est requise pour son intégration en stabilisant le complexe de recombinaison Xer. Mes résultats montrent que XafT est capable d’améliorer la réaction d’intégration de CTX. Cette protéine pourrait être le facteur apporté par TLC facilitant la conversion toxigénique de V. cholerae. De plus, j’ai identifié un nouveau facteur d’activation de Xer encodé par l’IMEX VGJΦ améliorant drastiquement sa propre intégration. J’ai montré que cette protéine, appelée XafV, était également capable d’améliorer l’intégration de CTX Ces résultats apportent de nouvelles informations sur le mode d’action des protéines Xaf et révèlent que les différents IMEX ont la capacité de coopérer au niveau de la réaction d’intégration.

Dans un second temps, je me suis intéressé à la particularité des souches pandémiques de toujours présenter deux copies de CTX intégrées en tandem. Des travaux antérieurs ont montré que cela permet la réplication de CTX depuis le chromosome, essentielle pour sa sortie de lysogénie. Cependant, le mécanisme par lequel CTX s’établit dans cette configuration n’a pas été exploré. J’ai d’abord mis en évidence une boucle de régulation positive par le SOS, permettant une réplication suffisante de CTX dans une souche sauvage. La production d'ADN simple brin par la réplication en cercle roulant semble activer la réponse SOS, ce qui active en retour la réplication de CTX. J’ai également montré que la réplication était entièrement abolie dans une souche possédant deux copies de CTX intégrées, indiquant que la réplication de CTX est limitée à deux copies pour un chromosome. De plus, cette capacité de réplication est couplée à un fort taux d’intégration en deux copies. La capacité d'intégration de CTX est fortement diminuée en absence de recA, lorsqu'on inactive la boucle réplicative. Ces résultats montrent que la régulation de la réplication de CTX permet un maintien de la forme réplicative jusqu’à l’intégration en tandem dans le chromosome. Pris ensemble, mes résultats éclairent deux aspects de la biologie des IMEX de Vibrio cholerae, qui sont fortement liés à l’évolution de la pathogénicité de cette bactérie.

Composition du jury:
Bernard Hallet, Professeur, Université Catholique de Louvain [Rapporteur]
Céline Loot, Directrice de Recherche, Institut Pasteur [Rapporteure]
Mireille Ansaldi, Directrice de Recherche, Université Aix-Marseille [Examinatrice]
Ombeline Rossier, Maîtresse de Conférence, Université Paris-Saclay [Examinatrice]

Title: Genesis of prophage arrays driving Vibrio cholerae toxigenicity

Abstract: The lysogenic filamentous bacteriophage CTX (Cholera ToXin), which encodes the cholera toxin, is responsible for the pathogenicity of the bacterium Vibrio cholerae, responsible for cholera. CTX integrates into its host's chromosome by exploiting the host's Xer machinery. Several other elements using this mechanism are found in the genome of pandemic strains of V. cholerae. Called IMEX (Integrative Mobile Elements exploiting Xer), they are all inserted at the dif site where the tyrosine recombinases XerC and XerD act, and form prophage arrangements that can vary depending on the number, order, and types of IMEX. Analysis of these arrangements has revealed characteristics common to all strains. My thesis seeks to explain some of these observations by revealing new aspects of the IMEX life cycle.

The satellite bacteriophage TLCΦ (Toxin-Linked Cryptic) is an IMEX invariably found upstream of CTX. It has been proposed that its integration first restores the functionality of an ancestral dif site, allowing the integration of CTX. However, I have shown that the ancestral dif site is functional. It allows the integration of CTX at the same level as the site reformed by TLC. I then looked for another reason to explain the presence of TLC in pandemic strains. The XafT protein encoded by TLC is required for its integration by stabilizing the Xer recombination complex. My results show that XafT is capable of enhancing the CTX integration reaction. This protein could be the factor brought by TLC that facilitates the toxigenic conversion of V. cholerae. In addition, I identified a new Xer activation factor encoded by the IMEX VGJΦ that drastically improves its own integration. I showed that this protein, called XafV, was also capable of enhancing CTX integration. These results provide new information on the mode of action of Xaf proteins and reveal that different IMEXs have the ability to cooperate in the integration reaction.
Secondly, I focused on the particularity of pandemic strains of always presenting two copies of CTX integrated in tandem. Previous work has shown that this allows CTX to replicate from the chromosome, which is essential for its exit from lysogeny. However, the mechanism by which CTX establishes itself in this configuration has not been explored. I first identified a positive feedback loop involving SOS, which allows sufficient CTX replication in a wild-type strain. The production of single-stranded DNA by rolling circle replication appears to activate the SOS response, which in turn activates CTX replication. I also showed that replication was completely abolished in a strain with two integrated copies of CTX, indicating that CTX replication is limited to two copies per chromosome. In addition, this replication capacity is coupled with a high rate of integration into two copies. The integration capacity of CTX is greatly reduced in the absence of recA, when the replication loop is inactivated. These results show that the regulation of CTX replication allows the replicative form to be maintained until tandem integration into the chromosome. Taken together, my results shed light on two aspects of the biology of Vibrio cholerae IMEXs, which are strongly linked to the evolution of the pathogenicity of this bacterium.