PhD defense - Mélissa Jin (eq. Urvoas - B3S dpt)

Mélissa Jin - eq. Urvoas - B3S dpt

Titre : Ingénierie de métalloenzymes artificielles pour la dégradation d’agents neurotoxiques

Composition du jury :
Yasmina MEKMOUCHE - Chargée de recherche CNRS, Institut des Sciences Moléculaires de Marseille - Rapportrice
Julien HENRI - Maître de conférences, Sorbonne Université, Institut de Biologie Paris - Seine - Rapporteur
Dominique GUIANVARC'H - Professeure, Université Paris-Saclay, Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d’Orsay - Examinatrice
Benoît D'AUTREAUX - Directeur de recherche INSERM, Institut de biologie intégrative de la cellule - Examinateur
Agathe URVOAS - Professeure, Université Paris-Saclay - Directrice de thèse
Marielle VALERIO-LEPINIEC - Maîtresse de conférences, Université Paris-Saclay - co-Directrice de thèse

Résumé : 
Les composés organophosphorés (OPC) sont des molécules à l’origine utilisées comme pesticides, mais également comme armes chimiques de guerre. L’utilisation intensive des pesticides organophosphorés pose un problème à la fois environnemental et sanitaire. Ce projet de thèse a pour objectif de développer des métalloenzymes capables d’hydrolyser des OPC afin de neutraliser leur toxicité, selon une approche multi-stratégique dans le cadre d’une collaboration entre 4 laboratoires de biochimistes et de chimistes. La première stratégie consiste à fabriquer des métalloenzymes artificielles (ArMs) en incorporant des complexes organométalliques, qui fournissent l’activité catalytique, dans une αRep, issue d'une famille de protéines artificielles thermostables, qui fournit un micro-environnement protéique permettant de moduler l’activité catalytique. Les αRep sont ici proposées comme des plateformes de protéines hôtes de choix pour cribler des complexes métalliques afin d’identifier la combinaison de protéine et de complexe métallique qui sera capable d’hydrolyser des OPCs en utilisant comme substrat un pesticide largement utilisé, le paraoxon (POX). Plusieurs combinaisons ont été identifiées, parmi elles, A3_A3 Y26C_Terpy : Co (II) est la plus prometteuse. La deuxième stratégie consiste à faire l’évolution dirigée d’une métalloenzyme humaine, la déoxyhypusine hydroxylase (DOHH), afin de modifier son site actif et la rendre spécifique pour l’hydrolyse d’OPC. Pour cela, des mutants de la DOHH ont été générés puis caractérisés pour étudier la stabilité des mutations uniques en alanine. A l’issue de ce processus des résidus ont été identifiés comme jouant un rôle dans la stabilité caractéristique de l’intermédiaire peroxo-diferrique formé dans le site actif de la DOHH. Douze positions de la cavité protéique de la DOHH ont été identifiées comme intéressantes à diversifier pour construire une banque de variants de la DOHH. Et pour finir, la DOHH et ses mutants ont montré une activité hydrolytique sur des substrats organophosphorés : le POX et un analogue fluorescent d’un agent organophosphoré utilisé comme arme chimique, l’agent VX, synthétisé par des collaborateurs chimistes. Ces résultats présentent la DOHH comme une protéine intéressante pour concevoir par évolution dirigée un biocatalyseur capable de détoxifier des OPC. Dans une dernière partie de la thèse, des protéines chimériques ont été générées afin de créer, d’une part, une nouvelle métalloenzyme, et, d’autre part, d’identifier les domaines de la DOHH nécessaires à la fixation des métaux. Les protéines chimériques ont été produites, purifiées et analysées par des méthodes biophysiques (MP-AES, SEC – RALS/LALS, FIDA etc…) afin de caractériser la conformation et le contenu en métaux des protéines. Les résultats ont été comparés à ceux de la DOHH. Bien qu’aucune des deux chimères ne fixaient le fer, la cristallogenèse a été initiée. L’analyse de la structure permettra de mieux comprendre ses propriétés afin de déterminer si cette chimère est une bonne protéine modèle pour poursuivre l’étude de la DOHH.