PhD defense - Liza Boëffard-Dosierre (eq. Charbonnier/Zinn - B3S dpt)

Résumé : 
Les formulations d’anticorps monoclonaux (mAb) à haute concentration sont essentielles pour l’administration sous-cutanée, car elles permettent d’administrer une forte dose thérapeutique dans de faibles volumes. Toutefois, à des concentrations supérieures à 100 mg/mL, les mAb ont tendance à s’auto-associer de façon réversible en oligomères transitoires, entraînant une forte augmentation de la viscosité. Cela complique la fabrication, la manipulation et l’injection du traitement et peut en compromettre la stabilité et l’efficacité. Pour limiter ces effets, des excipients, typiquement des acides aminés, des sucres ou des tensioactifs, sont ajoutés. Ils permettent de réduire les interactions protéine-protéine et d’assurer la stabilité du mAb. Cependant, leur sélection reste largement empirique, car leur impact sur l’auto-association et la viscosité demeure mal élucidé. Au cours de cette étude, une IgG évaluée lors d’essais cliniques par Sanofi a été utilisée comme modèle. Un ensemble de méthodes RMN complémentaires a été optimisé dans le but de détecter les interactions mAb :mAb et mAb :excipients dans des conditions standard de formulation. Ces méthodes incluent une analyse des signaux ¹H du mAb en présence de neuf excipients différents, des expériences à gradient de champ pulsé (PFG-RMN), une analyse des perturbations de déplacement chimique (CSP), des expériences de transfert de saturation (STD-RMN) et des mesures de relaxation transverse (R2). De manière complémentaire, la viscosité macroscopique des échantillons a été mesurée par rhéométrie, et la distribution en taille des oligomères de mAb a été analysée par diffusion dynamique de la lumière (DLS). Cette analyse s’est avérée complexifiée par les échanges entre monomères et clusters, confirmant la faible capacité de la DLS à décrire la distribution des espèces de mAb à haute concentration. De plus, les paramètres d’interaction déduits des analyses à faible concentration (kD) n’ont pas permis de prédire la viscosité à haute concentration. Cependant, les analyses par RMN ont permis de relier la viscosité macroscopique mesurée par rhéométrie avec les interactions moléculaires du mAb. Les intensités RMN 1D ¹H se sont révélées très sensibles à l’oligomérisation réversible du mAb. Après correction par la viscosité (mesurée par rhéométrie), une forte perte de signal RMN a été observée au-delà de 50 mg/mL, ce qui indique la formation d’oligomères transitoires (ou clusters). Parmi les neuf excipients testés, l’arginine et la lysine réduisent de manière significative la perte de signal RMN, et donc l’oligomérisation réversible du mAb. La majorité des excipients permettent de diminuer la viscosité macroscopique, les plus efficaces étant là encore l’arginine et la lysine. L’analyse R2 et les CSP ont montré que l’arginine, la lysine et le sucrose interagissent le plus fortement avec la surface du mAb, tandis que la glycine et les surfactants montrent des interactions plus faibles, essentiellement détectées en présence de clusters. Les STD-RMN se sont révélées particulièrement sensibles à l’état oligomérique du mAb et ont détecté de fortes interactions avec la lysine, tandis que les mesures en présence de proline ont montré une faible reproductibilité. 
Globalement, ce travail montre que la RMN est adaptée à l’étude des interactions faibles dans des solutions concentrées de mAb. Les données indiquent que la viscosité dépend non seulement du degré d’auto-association du mAb, mais aussi de la nature des interactions transitoires entre les différents clusters. Les interactions mAb-excipients peuvent contribuer à la régulation du réseau d’interactions formé par le mAb, mais ne peuvent à elles seules déterminer la viscosité macroscopique. La description mécanistique de l’auto-assemblage du mAb et du rôle des excipients par la RMN contribue à rationaliser les déterminants moléculaires de la viscosité.

 

Abstract: 
High-concentration monoclonal antibody (mAb) formulations are essential for subcutaneous administration, as they allow a high therapeutic dose to be administered in small volumes. However, at concentrations above 100 mg/mL, mAbs tend to reversibly self-associate into transient oligomers, leading to a sharp increase in viscosity. This complicates the manufacture, handling, and injection of the treatment and can compromise its stability and efficacy. To limit these effects, excipients, typically amino acids, sugars, or surfactants, are added. These reduce protein-protein interactions and ensure the stability of the mAb. However, their selection remains largely empirical, as their impact on self-association and viscosity remains poorly understood.
During this study, an IgG evaluated in clinical trials by Sanofi was used as a model. A set of complementary NMR methods was optimized with the aim of detecting mAb:mAb and mAb:excipient interactions under standard formulation conditions. These methods included analysis of ¹H signals from the mAb in the presence of nine different excipients, pulsed field gradient (PFG-NMR) experiments, chemical shift perturbation (CSP) analysis, saturation transfer (STD-NMR) experiments, and transverse relaxation (R2) measurements. In addition, the macroscopic viscosity of the samples was measured by rheometry, and the size distribution of mAb clusters was analyzed by dynamic light scattering (DLS). This analysis was complicated by exchanges between monomers and clusters, confirming the limited ability of DLS to describe the distribution of mAb species at high concentrations. Furthermore, the interaction parameters deduced from low-concentration analyses (kD) did not allow the viscosity at high concentrations to be predicted. However, NMR analyses made it possible to link the macroscopic viscosity measured by rheometry with the molecular interactions of the mAb. The 1D ¹H NMR intensities proved to be very sensitive to reversible oligomerization of the mAb. After correction for viscosity (measured by rheometry), a significant loss of NMR signal was observed above 50 mg/mL, indicating the formation of transient oligomers (or clusters). Among the nine excipients tested, arginine and lysine significantly reduced the loss of NMR signal, and therefore the reversible oligomerization of the mAb. Most excipients reduced macroscopic viscosity, with arginine and lysine again being the most effective. 
R2 analysis and CSPs showed that arginine, lysine, and sucrose interact most strongly with the surface of the mAb, while glycine and surfactants show weaker interactions, mainly detected in the presence of clusters. STD-NMR proved to be particularly sensitive to the reversible oligomeric state of the mAb and detected strong interactions with lysine, while measurements in the presence of proline showed low reproducibility. 
Overall, this work shows that NMR is suitable for studying weak interactions in concentrated mAb solutions. The data indicate that viscosity depends not only on the degree of mAb self-association, but also on the nature of the transient interactions between different clusters. mAb-excipient interactions may contribute to the regulation of the interaction network formed by the mAb, but cannot alone determine macroscopic viscosity. The mechanistic description of mAb self-assembly and the role of excipients by NMR helps to rationalize the molecular determinants of viscosity.