PhD defense - Armelle Gesnik (eq. Charbonnier/Zinn - B3S dpt)

Résumé : 
Les cassures double-brin (CDBs) de l’ADN sont des lésions génotoxiques induites par des facteurs endogènes ou exogènes. Leur réparation s’effectue principalement via deux voies : la recombinaison homologue (HR) ou la jonction d’extrémités non homologues (NHEJ). La voie classique du NHEJ est initiée par la fixation de l’hétérodimère Ku70/Ku80 (Ku) aux extrémités de l’ADN, suivie du recrutement d’autres acteurs de la voie grâce à de courts motifs peptidiques appelés Ku-Binding Motifs (KBM). Si les CDBs accidentelles sont délétères, les CDB programmées (prCDBs) sont au contraire essentielles à certains processus physiologiques. Chez les vertébrés, le complexe RAG1/RAG2 introduit des prCDBs au niveau des séquences RSS afin d’initier la recombinaison V(D)J, mécanisme indispensable à la diversification du répertoire immunitaire. Leur réparation est assurée par la voie NHEJ. Chez la paramécie, organisme unicellulaire à dimorphisme nucléaire, la transposase domestiquée PiggyMac (Pgm) et ses partenaires les PgmL1 à PgmL5, orchestrent l’excision précise des séquences internes éliminées (IES) lors des réarrangements programmés du génome. Ce processus est d’autant plus intrigant que la paramécie possède plusieurs homologues de Ku70 et Ku80. Toutefois, seul l’hétérodimère Ku70a/Ku80c participe aux réarrangements génomiques, suggérant une spécialisation fonctionnelle de Ku80c. Ainsi, chez les vertébrés comme chez la paramécie, les prCDBs révèlent une synergie étroite entre clivage et réparation de l’ADN. Au cours de ma thèse, j’ai mis en évidence, par calorimétrie isotherme, une interaction entre le domaine C-terminal de RAG2 et l’hétérodimère Ku, et caractérisé les résidus de RAG2 impliqués, identifiant ainsi un nouveau KBM. En parallèle, j’ai analysé les interactions des différents homologues de Ku de la paramécie par des approches biophysiques et de microscopie électronique en transmission, révélant des comportements différents entre les homologues. Enfin, j’ai initié l’étude structurale du complexe d’endonucléases, notamment de l’hétérodimère PgmL1-PgmL3, par cryo-microscopie électronique.

 

Abstract: 
DNA double-strand breaks (DSBs) are genotoxic lesions induced by endogenous or exogenous factors. Their repair mainly relies on two pathways: homologous recombination (HR) or non-homologous end joining (NHEJ). The classical NHEJ pathway is initiated by the binding of the Ku70/Ku80 (Ku) heterodimer to DNA ends. Ku subsequently recruits other NHEJ factors through short peptide sequences known as Ku-Binding Motifs (KBM). While accidentals DSBs are deleterious, programmed DSBs (prDSBs) are essential for specific physiological processes. In vertebrates, the RAG1/RAG2 complex introduces prDSBs at recombination signal sequences (RSS) to initiate the V(D)J recombination, a mechanism indispensable for diversifying the immune repertoire. The repair of these prDSBs is ensured by the NHEJ pathway. In Paramecium, a unicellular organism with nuclear dimorphism, the domesticated transposase PiggyMac (Pgm) and its partners, the PiggyMac-Like proteins (PgmL1 to PgmL5), orchestrate the precise excision of internal eliminated sequences (IES) during programmed genome rearrangements. This process is particularly intriguing because Paramecium possesses several Ku70 and Ku80 homologs. However, only the Ku70a/Ku80c complex is involved in genome rearrangements, suggesting a functional specialization of Ku80c. Thus, in both vertebrates and Paramecium, prDSBs reveal a tight synergy between DNA cleavage and repair mechanisms. During ma PhD, I demonstrated by isothermal titration calorimetry that the C-terminal domain of RAG2 interacts with Ku and identified within it a novel KBM. In parallel, I analyzed the interaction of different Paramecium Ku homologs with DNA using biophysical approaches and transmission electron microscopy, revealing distinct behaviors between homologs. Finally, I initiated the structural study of the endonuclease complex, focusing on the PgmL1-PgmL3 heterodimer, using cryo-electron microscopy.