PhD Defense Suliane QUILLERE "Caractérisation des propriétés de liaison de la protéine intrinsèquement désordonnée BRCA2 identifiée chez Physcomitrium patens" (eq. Charbonnier / Zinn-Justin - B3S dpt)

La réparation des cassures double brin (DSB) est cruciale pour garantir l’intégrité du génome. Durant la phase S de la mitose et en méiose, elle est réalisée par un processus appelé recombinaison homologue (RH). La protéine BRCA2 est au cœur de ce mécanisme. Elle interagit avec les protéines d’échange de brins (ou recombinases) RAD51 et DMC1 par l’intermédiaire de motifs conservés A et P. Les motifs A, présents dans les huit répétitions BRC de la région centrale de la BRCA2 humaine, entrent en compétition avec les régions de RAD51 et DMC1 responsables de leur oligomérisation. Ainsi, les répétitions BRC se lient aux recombinases monomériques. À l’inverse, deux motifs P ont été identifiés dans la BRCA2 humaine. Ils interagissent respectivement avec les formes oligomériques de RAD51 et DMC1, et contribuent à la stabilisation des filaments nucléoprotéiques. L’organisme végétal modèle Physcomitrium patens constitue un système d’étude pertinent pour la HR en raison de l’architecture relativement simple de son génome et de son taux élevé de RH. Notre collaborateur Rajeev Kumar (IJPB, Versailles) a identifié chez la mousse une protéine qui partage des motifs A appelés répétitions BRC avec la BRCA2 humaine. Son équipe a démontré que cette protéine PpBRCA2 est essentielle au maintien de l’intégrité du génome, à la réparation somatique des DSB de l’ADN, à la formation des foyers de PpRAD51 au niveau de ces cassures ainsi qu’au ciblage génique médié par la RH. PpBRCA2 est également critique pour la réparation des DSB lors de la méiose. Par co-immunoprécipitation et spectrométrie de masse, un ensemble de partenaires de PpBRCA2 a été identifié, incluant les recombinases PpRAD51-1 et PpRAD51-2 ainsi que l’hélicase PpRADA. Mes travaux de thèse se sont concentrés sur la caractérisation de ces interactions et sur la conception de mutations visant à les perturber, afin de fournir des outils pour découvrir la fonction de ces interactions chez la mousse. PpBRCA2 diffère de la BRCA2 humaine car elle est environ 10 fois plus courte (391 aa) et ne possède pas de domaine replié de liaison à l’ADN. J’ai démontré que PpBRCA2 est entièrement désordonnée et j’ai révélé que sa région N-terminale, chargée positivement, se lie à l’ADN simple brin (ssDNA), comme cela a été rapporté pour deux motifs désordonnés distincts de la BRCA2 humaine. J’ai également observé que la région C-terminale de PpBRCA2, chargée négativement, contient quatre répétitions BRC. Trois de ces répétitions présentent individuellement une liaison micromolaire à PpRAD51-2, tandis que la région C-terminale affiche une affinité apparente nanomolaire pour PpRAD51-2. Enfin, j’ai recherché des motifs P au sein de PpBRCA2. J’ai montré que PpBRCA2 stabilise les filaments ssDNA-RAD51-2 via le motif FNAP, notamment grâce à sa phenylalanine F123. J’ai résolu par cryo-EM les structures des filaments ssDNA- et dsDNA-PpRAD51-2 en présence de la protéine PpBRCA2 entière, de son domaine N-terminal ou d’un peptide de 19 aa comprenant le motif FNAP. Dans toutes ces cartes de cryo-EM, j’ai observé que le fragment K120-P130 de PpBRCA2 est ancré de manière stable sur une protéine PpRAD51-2. De plus, j’ai identifié un nouveau site de faible affinité situé entre K90 et R99. Grâce à ces sites de liaison, PpBRCA2 pourrait ponter deux protomères de PpRAD51-2 au sein des filaments nucléoprotéiques, contribuant ainsi à les stabiliser. Enfin, j’ai initié la caractérisation de l’interaction entre PpBRCA2 et PpRADA, afin de confimer que la région N-terminale de PpBRCA2 lie directement l’hexamère de PpRADA. Globalement, mes travaux ont révélé des similitudes mais aussi des différences entre les mécanismes de RH chez l’homme et la mousse, et ont bénéficié de la possibilité de tester chez la mousse l’impact de mutations sur la stabilité génétique, la croissance et la fertilité.