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PhD Defense
PhD defense - Yingyue Luo (eq. Charbonnier/Zinn - B3S dpt)
par
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Europe/Paris
B21-N0-00 - Auditorium (I2BC CNRS Gif)
Description
Yingyue Luo - INTGEN - B3S dpt
Titre : Caractérisation structurale des interactions phospho-dépendantes entre Mdm2 et p53 entiers
Composition du jury :
Olivier LEQUIN - Rapporteur & Examinateur, Professeur, Université Sorbonne
Bruno KIEFFER - Rapporteur & Examinateur, Professeur, Université de Strasbourg
Herman VAN TILBEURGH - Président, Professeur, Université Paris-Saclay
Isabelle LANDRIEU - Examinatrice, Directrice de recherche, Université de Lille
Christina SIZUN - Examinatrice, Directrice de recherche, Université Paris-Saclay
François-Xavier THEILLET - Directeur de thèse
Résumé :
La E3 ubiquitine ligase Mdm2 est le principal régulateur négatif du suppresseur de tumeur p53. L’axe de régulation Mdm2–p53 est altéré dans la quasi-totalité des cancers, ce qui en fait une cible thérapeutique majeur. Des inhibiteurs empêchant la liaison de p53 à Mdm2 ont été testés en clinique, mais leurs résultats restent à ce jour limités.
Jusqu’à présent, les études biochimiques et biophysiques sur l’interaction Mdm2–p53 ont été réalisées à partir des domaines isolés, non phosphorylés. Or, Mdm2 est une protéine de 491 acides aminés alternant domaines repliés et régions désordonnés. Ces dernières sont phosphorylées par deux grandes classes de kinases : (i) en conditions physiologiques, CK1 cible la région intrinsèquement désordonnée (IDR1) de Mdm2, tandis que (ii) en réponse à des dommages à l’ADN, les kinases ATM/ATR/DNAPK sont activées et phosphorylent la seconde région désordonnée (IDR2). Nous avons émis l’hypothèse que ces phosphorylations pourraient moduler les contacts interdomaines et, par conséquent, l’activité de Mdm2 ou ses affinités pour ses partenaires protéiques. Je présenterai ici la caractérisation de Mdm2 entière sous ses formes phosphorylées proches de l’état natif, c’est-à-dire bien plus représentatives des conditions physiologiques que les études précédentes.
J’ai produit, par expression recombinante, plusieurs fragments contenant l'IDR1 et/ou l'IDR2 ainsi que Mdm2 entière, et j’ai utilisé la spectroscopie RMN pour suivre, de manière site-spécifique, leurs phosphorylations. J’ai identifié 15 sites de phosphorylation dépendantes de CK1 sur l'IDR1, et caractérisé les mécanismes de phosphorylation associés.
Par la suite, j’ai caractérisé, par RMN, les paramètres de relaxation et les interactions intramoléculaires entre les trois domaines structurés de Mdm2 et les régions IDR1/IDR2, dans leurs formes non modifiées et phosphorylées. Afin d’examiner si ces interactions interdomaines faibles pouvaient moduler l’activité de Mdm2, j’ai mesuré par calorimétrie isotherme (ITC) les affinités entre différents fragments de Mdm2 (contenant l'IDR1 et/ou l'IDR2 ainsi Mdm2 entière dans leurs états non modifiés et phosphorylés) et p53. Bien que les IDRs contribuent à des interactions additionnelles avec p53, leurs interactions intramoléculaires entrent en compétition avec p53. Ainsi, elles réduisent l’affinité globale de Mdm2 pour p53 d’un facteur d’environ 10~30 selon les états de phosphorylation en comparaison avec les affinités mesurées pour les domaines isolés.
Ce travail constitue une étude structurale pionnière sur des IDRs hyperphosphorylées au sein d’une protéine multidomaine combinant des régions structurées et désordonnées. Ce type d’architecture est fréquent chez les protéines eucaryotes, mais encore peu décrit sur le plan structural. Mes résultats apportent un éclairage nouveau sur la régulation de l’axe p53/Mdm2 et pourraient encourager des études similaires sur de nombreuses cibles thérapeutiques présentant une organisation multidomaine comparable.
Jusqu’à présent, les études biochimiques et biophysiques sur l’interaction Mdm2–p53 ont été réalisées à partir des domaines isolés, non phosphorylés. Or, Mdm2 est une protéine de 491 acides aminés alternant domaines repliés et régions désordonnés. Ces dernières sont phosphorylées par deux grandes classes de kinases : (i) en conditions physiologiques, CK1 cible la région intrinsèquement désordonnée (IDR1) de Mdm2, tandis que (ii) en réponse à des dommages à l’ADN, les kinases ATM/ATR/DNAPK sont activées et phosphorylent la seconde région désordonnée (IDR2). Nous avons émis l’hypothèse que ces phosphorylations pourraient moduler les contacts interdomaines et, par conséquent, l’activité de Mdm2 ou ses affinités pour ses partenaires protéiques. Je présenterai ici la caractérisation de Mdm2 entière sous ses formes phosphorylées proches de l’état natif, c’est-à-dire bien plus représentatives des conditions physiologiques que les études précédentes.
J’ai produit, par expression recombinante, plusieurs fragments contenant l'IDR1 et/ou l'IDR2 ainsi que Mdm2 entière, et j’ai utilisé la spectroscopie RMN pour suivre, de manière site-spécifique, leurs phosphorylations. J’ai identifié 15 sites de phosphorylation dépendantes de CK1 sur l'IDR1, et caractérisé les mécanismes de phosphorylation associés.
Par la suite, j’ai caractérisé, par RMN, les paramètres de relaxation et les interactions intramoléculaires entre les trois domaines structurés de Mdm2 et les régions IDR1/IDR2, dans leurs formes non modifiées et phosphorylées. Afin d’examiner si ces interactions interdomaines faibles pouvaient moduler l’activité de Mdm2, j’ai mesuré par calorimétrie isotherme (ITC) les affinités entre différents fragments de Mdm2 (contenant l'IDR1 et/ou l'IDR2 ainsi Mdm2 entière dans leurs états non modifiés et phosphorylés) et p53. Bien que les IDRs contribuent à des interactions additionnelles avec p53, leurs interactions intramoléculaires entrent en compétition avec p53. Ainsi, elles réduisent l’affinité globale de Mdm2 pour p53 d’un facteur d’environ 10~30 selon les états de phosphorylation en comparaison avec les affinités mesurées pour les domaines isolés.
Ce travail constitue une étude structurale pionnière sur des IDRs hyperphosphorylées au sein d’une protéine multidomaine combinant des régions structurées et désordonnées. Ce type d’architecture est fréquent chez les protéines eucaryotes, mais encore peu décrit sur le plan structural. Mes résultats apportent un éclairage nouveau sur la régulation de l’axe p53/Mdm2 et pourraient encourager des études similaires sur de nombreuses cibles thérapeutiques présentant une organisation multidomaine comparable.
Abstract:
The E3-ubiquitin ligase Mdm2 is the main negative regulator of the "tumor suppressor" p53. The Mdm2-p53 regulatory axis is altered in nearly all cancers, which makes it an attractive anti-cancer target. Inhibitors of p53 binding to Mdm2 have been tested in clinic, but yielded limited success up to now.
So far, all the biochemical/biophysical works on Mdm2-p53 have been achieved using isolated domains in non-phosphorylated forms. However, Mdm2 is a 491-residue long protein, alternating folded and disordered domains. The latter ones are phosphorylated by two classes of kinases i) under normal conditions, CK1 phosphorylates the Intrinsic Disorder Region 1 (IDR1) of Mdm2, whereas ii) in response to DNA damage, ATM/ATR/DNAPK kinases are activated and phosphorylate the IDR2 of Mdm2. We hypothesized that these phosphorylation schemes may tune interdomain contacts, which, in turn, would regulate Mdm2 activity or affinities for its protein partners. Here, I report our characterization of full-length Mdm2 in close-to-native phosphorylation forms, i.e. much closer to physiological conditions.
I characterized the hyperphosphorylated forms of Mdm2, which are representative of those present in cells. I have produced recombinantly a number of fragments containing IDR1 and/or IDR2, and the full-length protein, and used NMR spectroscopy to monitor their phosphorylation in a site-specific fashion.
I identified 15 CK1-dependent phosphorylation sites on IDR1, and elucidated the corresponding phosphorylation mechanisms. Then, I have characterized the NMR relaxation and the intramolecular interactions between the 3 folded domains of Mdm2 and IDR1/2, in both non-modified and phosphorylated forms.
To investigate whether the weak interdomain interactions might tune Mdm2 activity, I performed isothermal titration calorimetry (ITC) to quantify affinities between various fragments Mdm2 (containing IDR1 and/or IDR2, and the full-length protein, in the non-modified and in the phosphorylated forms) and p53. Although IDRs establish supplementary binding to p53, their intramolecular interactions compete with p53 and diminish the affinity for p53 by a factor ~10 to 30, depending on the constructs.
This work presents a pioneering structural study on hyperphosphorylated IDRs within a multidomain protein combining folded and unfolded domains. Such proteins are very common in eukaryotic cells but much less structurally characterized in the literature. My findings offer new insights into the regulatory axis p53/Mdm2 and may motivate similar studies on many drug targets with similar multidomain compositions.
So far, all the biochemical/biophysical works on Mdm2-p53 have been achieved using isolated domains in non-phosphorylated forms. However, Mdm2 is a 491-residue long protein, alternating folded and disordered domains. The latter ones are phosphorylated by two classes of kinases i) under normal conditions, CK1 phosphorylates the Intrinsic Disorder Region 1 (IDR1) of Mdm2, whereas ii) in response to DNA damage, ATM/ATR/DNAPK kinases are activated and phosphorylate the IDR2 of Mdm2. We hypothesized that these phosphorylation schemes may tune interdomain contacts, which, in turn, would regulate Mdm2 activity or affinities for its protein partners. Here, I report our characterization of full-length Mdm2 in close-to-native phosphorylation forms, i.e. much closer to physiological conditions.
I characterized the hyperphosphorylated forms of Mdm2, which are representative of those present in cells. I have produced recombinantly a number of fragments containing IDR1 and/or IDR2, and the full-length protein, and used NMR spectroscopy to monitor their phosphorylation in a site-specific fashion.
I identified 15 CK1-dependent phosphorylation sites on IDR1, and elucidated the corresponding phosphorylation mechanisms. Then, I have characterized the NMR relaxation and the intramolecular interactions between the 3 folded domains of Mdm2 and IDR1/2, in both non-modified and phosphorylated forms.
To investigate whether the weak interdomain interactions might tune Mdm2 activity, I performed isothermal titration calorimetry (ITC) to quantify affinities between various fragments Mdm2 (containing IDR1 and/or IDR2, and the full-length protein, in the non-modified and in the phosphorylated forms) and p53. Although IDRs establish supplementary binding to p53, their intramolecular interactions compete with p53 and diminish the affinity for p53 by a factor ~10 to 30, depending on the constructs.
This work presents a pioneering structural study on hyperphosphorylated IDRs within a multidomain protein combining folded and unfolded domains. Such proteins are very common in eukaryotic cells but much less structurally characterized in the literature. My findings offer new insights into the regulatory axis p53/Mdm2 and may motivate similar studies on many drug targets with similar multidomain compositions.
